• 内蒙古伊利实业集团股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-02-15
  • 游泳池水质可手机扫码查询 数据5分钟更新一次 2019-02-15
  • 海南自贸区(港)开建一批100亿级产业项目 2019-02-10
  • 5月末商品房库存继续减少 三、四线城市开启库存短缺时代 2019-01-24
  • 杀菌-热门标签-华商生活 2019-01-18
  • 安徽军工集团控股有限公司 2018-12-31
  • 家中被盗竟是女友所为 未曾想24岁女友竟已年近50 2018-12-31
  • 2013第八届中国常州先进制造技术成果展示洽谈会——中国常州网专题 2018-12-26
  • 俄罗斯世界杯今日开战,送上最全观赛指南!你最看好哪支球队? 2018-12-26
  • 苹果市值9370亿美元 在标普500成分股中占比为4% 2018-11-29
  • 昭君怨旧貌新景—zhuopushitou的博客—强国博客—人民网 2018-11-29
  • 客服热线:400-901-9800          客服QQ:4009019800          技术答疑     技术支持     质量反馈     联系我们
    首页 > 新闻动态 > 正文
    Bioss流式讲堂|多色搭配大师懂这些就够了
    发表者:北京博奥森生物      发表时间:2018-10-30

    知识要点:荧光标记的流式抗体种类繁多,荧光素的激发光谱与发射光谱各异,给抗体选择、荧光搭配等带来了诸多困扰。需要注意:荧光素的激发波长需要与可激发发光的激光器匹配,荧光素的激发光谱峰值尽可能接近仪器激光的激发光波长。此外,荧光素的激发波长必须选用相应波段检测器接收,以达到同时检测的目的。


    荧光素的搭配依据

    流式抗体荧光标记搭配主要由3个因素决定:流式细胞仪检测的通道数、需要同时检测的荧光抗体数、厂家抗体的荧光种类及数目。
    (1) 激光管数目以及每根激光的功能决定检测的通道数量,即可同时检测的指标数量。注意以下两点:
    ① 流式细胞仪有哪些激光。比如标配的FACSCalibur只有一根488nm的激光,能做FL1/ FL2/ FL3三个颜色;而选配的FACSCalibur配有488nm和635nm两根激光,能做FL1/ FL2/ FL3/ FL4四个颜色。
    ② 不同型号的仪器同一通道检测荧光素的能力是不一样的,比如FACSCalibur的FL3能检测PE-Cy5/PerCP/PerCP-Cy5.5/PE-Cy7,而Aria只能检测PE-Cy5/PerCP。


    (2) 需要同时检测的指标数量超过了仪器能力范围:拆开分管标记。如下例,

    计划检测5个指标,而流式细胞仪只有4个通道,首先将指标归成2类,再将样本分成2份,分别检测。如同时检测CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma,那么将样本分成两份,第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4,而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。

    (3) 厂家提供的荧光素种类及数目:供应商能提供的每种抗体的荧光素是不一样的。尽量选择说明书中有流式图的抗体。

    不同型号流式细胞仪的检测通道及可应用的荧光素[1]

    荧光素搭配原则:
    (1) 根据仪器选择荧光素
    ① 每个通道只能选择一个荧光素
    以calibur为例,FL1选择了FITC就不能选择AlexaFluor488; FL3可检测PE-Cy5 / PerCP / PerCP-Cy5.5等5种荧光,但荧光搭配时只能选择一种荧光被此接收器检测。
    ② 各通道之间荧光素可随意搭配
    如果流式细胞仪有4个通道,每个通道选出1个荧光素就可以组成4个颜色。
    (2) 搭配的荧光素之间发射光谱重叠尽量小
    荧光的最大发射波长相差越大,荧光重叠就越小,这是由荧光光谱特征决定的。另外,不建议联用APC和Cy5串联荧光,因为他们之间光谱重叠较大,荧光补偿不易调节。

    4色以内流式分析荧光素抗体组合

    PerCP

    FITC、PE

    PE-Cy5

    FITC、PE

    PE-Cy5.5

    FITC、PE、APC

    PE-Cy7

    FITC、PE、APC



    6色、8色、10色流式分析荧光素抗体组合

    6

    8

    10

    FITCAlexa Fluor 488

    FITC FITC Alexa Fluor 488

    FITCAlexa Fluor 488

    PE

    PE

    PE

    PE-Texas RedPE- Alexa Fluor610

    PerCP-Cy5.5

    PerCP-Cy5.5

    PerCP-Cy5.5

    PE-Cy7

    PE-Cy7

    PE-Cy7

    APCAlexa Fluor647

    APC Alexa Fluor647

    APC Alexa Fluor647

    APCAlexa Fluor680Alexa Fluor700

    APC-Cy7APC-H7

    APC-Cy7APC-H7

    APC-Cy7APC-H7

    AmCyanBD Horizon V500

    AmCyanBD Horizon V500

    BD Horizon V450

    BD Horizon V450



    荧光选择注意事项:
    1.选择荧光素应考率的因素
    ① 抗原密度:高表达抗原可以选择任何荧光素标记的抗体检测,低表达的抗原需要用较量荧光素(如PE/APC)标记的抗体检测,从而达到有效区分阴性细胞和阳性细胞的目的。
    ② 降低自发荧光:选择高波长范围里的荧光染料,自发光在高波长范围里(>600nm)迅速降低。

    2.应用FITC标记抗体避免使用酸性缓冲液
    应用FITC标记抗体时,避免使用酸性缓冲溶液,因为FITC的荧光特性是PH依赖性的。

    3.串联染料确保未发生解偶联
    串联染料有可能会发生解偶联,对“光漂白”和使用固定剂的“固定时间”更加敏感。建议设置一个“串联染料单染”作为对照,并在其他通道检测荧光的情况作为对比,以确保未发生解偶联。例如,应用PE/Cy5单染做对照时,分析PE通道的荧光信号。
    [1] 刘艳荣. 实用流式细胞术. 北京:北京大学医学出版社,2017(3-39).

    版权所有 2016-2020 南粤风采36选7最新开奖 www.gtxm.net 北京博奥森生物技术有限公司 京ICP备05066980号 京公网安备110107000727号
    通过国际质量管理体系ISO9001:2008 GB/T19001-2008认证    编号:00115Q211807R1M/1100
  • 内蒙古伊利实业集团股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-02-15
  • 游泳池水质可手机扫码查询 数据5分钟更新一次 2019-02-15
  • 海南自贸区(港)开建一批100亿级产业项目 2019-02-10
  • 5月末商品房库存继续减少 三、四线城市开启库存短缺时代 2019-01-24
  • 杀菌-热门标签-华商生活 2019-01-18
  • 安徽军工集团控股有限公司 2018-12-31
  • 家中被盗竟是女友所为 未曾想24岁女友竟已年近50 2018-12-31
  • 2013第八届中国常州先进制造技术成果展示洽谈会——中国常州网专题 2018-12-26
  • 俄罗斯世界杯今日开战,送上最全观赛指南!你最看好哪支球队? 2018-12-26
  • 苹果市值9370亿美元 在标普500成分股中占比为4% 2018-11-29
  • 昭君怨旧貌新景—zhuopushitou的博客—强国博客—人民网 2018-11-29